目的:应用近年发展的基因编辑技术成簇规律间隔短回文重复序列( clustered regularly interspaced short palindromic repeat, CRISPR)引导的Cas9核酸酶特异性靶向切割HBV DNA基因。方法基于慢病毒载体的lentiCRISPRv2系统,我们设计了3个特异靶向HBV基因组的向导RNA序列( guide RNA, gRNA)。质粒pUC18-HBV1.2和lentiCRISPR-gRNAs共转染HepG2细胞,或lentiCRISPR-gRNAs与相关慢病毒载体转染293T细胞后产生相应慢病毒。用慢病毒处理整合了HBV DNA的HepG2.2.15细胞或者HepDE19细胞系;并用慢病毒处理基于C57BL/6小鼠腺相关病毒HBV复制模型。结果单靶向CRISPR/Cas9切割可以抑制30%~50%病毒蛋白产生。两个或三个靶向切割则显著提高抑制效率,可达70%~90%。以慢病毒体系处理HepG2.2.15或HepDES19细胞时, HepDES19细胞中HBeAg下降幅度约为HepG2.2.15细胞中的3倍。 HBV复制小鼠模型在CRISPR/Cas9慢病毒处理后,血清中HBsAg和HBeAg可转为阴性。结论 CRISPR/Cas9系统多位点靶向切割可高效清除细胞内基因组,相对于整合于染色体的基因组,游离于细胞核的HBV基因组对此靶向切割系统更加敏感。
作者:鲁宇青;韩进超;丛旭;魏来;潘孝本
来源:中华实验和临床病毒学杂志 2016 年 1期