目的 构建Fibulin-5真核表达载体并转染人膀胱癌5637细胞.方法 经聚合酶链反应(PCR)扩增Fibulin-5 cDNA,然后将其与pMD-19T载体连接.pMD-19T-Fibulin-5重组体经过限制性内切酶Xho Ⅰ和EcoR Ⅰ的消化后产生Xho Ⅰ-Fibulin5-EcoR Ⅰ片段.将该片段插入增强型绿色荧光蛋白载体(p-EGFP N1)质粒的相似位点并最终合成p-EGFP-F5质粒重组体,并通过BgⅢ单酶切鉴定.通过脂质体介导法将p-EGFP-F5质粒转染至人膀胱癌5637细胞株内.结果 PCR扩增片段长度为1429 bp.Xho Ⅰ和EcoR Ⅰ双酶切的片段经DNA测序显示Fibulin-5 cDNA插入正确.p-EG-FP-F5质粒重组体经BgⅢ单酶切出一约450 bp的条带.转染48 h后,pEGFP-Fibulin-5和pEGFP-N1转染成功的细胞均有不同程度的绿色荧光表达.结论 成功构建Fibulin-5绿色荧光蛋白真核表达载体并转染至人膀胱癌细胞内.
作者:闫永吉;李炯明;刘建和;陈戬;姜永明;张劲松
来源:中华实验外科杂志 2012 年 29卷 4期