目的 构建具备表达超抗原金黄色葡萄球菌肠毒素A(SEA)基因的低免疫原性慢病毒载体,以期发挥高效激活T细胞抗肿瘤作用.方法 应用聚合酶链反应(PCR)获取大小分别为851 bp的人端粒酶反转录酶(hTERT)-CMV启动子序列及774 bp的SEA目的基因,将目的基因构建到慢病毒载体质粒中,基因测序正确后,转入感受态细胞DH5α中扩增、收集.利用穿梭质粒和包装质粒共转染293FT细胞中包装病毒,超速离心浓缩法收集病毒上清液,荧光滴度法检测病毒滴度.感染复数(MOI)=10病毒上清转染膀胱肿瘤细胞BIU-87细胞株,收集PCR产物测序目的基因,Western blot法检测SEA基因表达.结果 载体质粒大小为10 458 bp,基因测序正确,无明显碱基突变.荧光滴度法检测病毒滴度为(4.30 ±2.00)×109 TU/ml.PCR产物测序目的基因证实目的基因正确,分光光度计检测24、48、96 h总RNA产物分别为742、803、726 mg/L.Western blot结果显示SEA基因成功表达.结论 成功构建携带超抗原SEA基因低免疫原性病毒.
作者：周蓓；胡建鹏；邵晨；崔飞伦
来源：中华实验外科杂志 2017 年 34卷 10期
