目的构建靶向基质金属蛋白酶1组织抑制剂(TIMP-1)的短发夹RNA(shRNA)表达载体,并观察其对大鼠肾小球系膜细胞的凋亡和细胞外基质分泌的影响.方法构建携带绿色荧光蛋白(EGFP)基因的RNA干扰真核表达载体pEGFP-1/TIMP-1 shRNA,利用该载体介导两个TIMP-1 shRNA,分别为TIMP-1 shRNA1和TIMP-1 shRNA2.用荧光显微镜观察EGFP的表达.采用RT-PCR和Western印迹测定宿主细胞TIMP-1在基因和蛋白水平的沉默效果.用ELISA检测细胞外基质成份的表达.以流式细胞仪检测细胞的凋亡情况.结果(1)测序证实成功构建了针对TIMP-1的shRNA表达载体pEGFP-1/TIMP-1 shRNA;(2)荧光显微镜下,转染组细胞内均见绿色荧光;未转染组未见绿色荧光;(3)基因和蛋白水平的检测显示,与阴性对照组相比,TIMP-1 shRNA1组的TIMP-1明显受抑制(P＜0.05),TIMP-1 shRNA2组抑制效果不明显;(4)ELISA结果显示,正常对照组FN、Ⅳ型胶原蛋白和LN的表达不随时间的延长而变化;未转染组和阴性对照组在高糖诱导下,FN、Ⅳ型胶原蛋白和LN的表达随时间的延长而增加;48、72 h的shRNA1组、抗体组和反义组对FN、Ⅳ型胶原蛋白、LN表达明显低于阴性对照组,以shRNA1组最明显;(5)流式细胞仪结果显示,高糖诱导的各组细胞凋亡率随时间的延长而升高.在同一时间点shRNA1组细胞的凋亡

作者：孙艳玲；林洪丽；吴泰华；王楠；于长青；李龙凯；王静

来源：中华肾脏病杂志 2006 年 22卷 6期