目的：构建肺炎链球菌ciaH基因敲除（ΔciaH）突变株，了解肺炎链球菌二元信号系统CiaH／CiaR中ciaH基因与β-内酰胺类抗生素耐药的相关性。方法采用PCR 扩增肺炎链球菌ATCC6306株ciaH基因片段，T-A克隆后测序。构建用于敲除ciaH基因的自杀质粒pEVP3ciaH ，CaCl2法将其转化入肺炎链球菌ATCC6306株，通过同源重组、插入失活及氯霉素筛选获得肺炎链球菌ATCC6306株ciaH基因敲除突变株ΔciaH。采用PCR、测序及激光共聚焦显微镜法对ΔciaH突变株进行鉴定。采用二倍琼脂稀释法测定并比较青霉素G（ PCN）或头孢噻肟（ CTX）对ΔciaH突变株和野生株最低抑菌浓度（ MIC）及其差异。采用实时荧光定量RT-PCR（ qRT-PCR）检测1／4 MIC PCN或CTX作用前后ciaH-mRNA水平变化。结果 PCR和测序结果显示，所构建的ΔciaH突变株染色体DNA中ciaH基因被插入失活；免疫荧光法检测结果显示，ΔciaH突变株不表达CiaH蛋白。 PCN和CTX对ΔciaH突变株MIC分别为32μg／ml 和64μg／ml，明显高于野生株的0．06μg／ml 和1μg／ml （ P＜0．01）。1／4 MIC PCN或CTX作用后，肺炎链球菌ciaH-mRNA水平显著升高（P＜0．01）。结论肺炎链球菌CiaH／CiaR二元信号系统中CiaH与其对β-内酰胺类抗生素耐药性有关。
作者：张少妮；孙颜红；楼永良；严杰；孙爱华
来源：中华微生物学和免疫学杂志 2015 年 9期
