目的:以tRNAva1-shRNA表达框技术筛选高效的HBV C基因siRNA靶位.方法:针对HBV C基因序列设定5个siRNA靶位,以一步重叠延伸PCR技术生成含tRNAva1启动子的shRNA表达框(SEC),分别与HBV C基因与EGFP融合表达质粒(pC-EGFP)共转染AD293细胞,转染后48 h,流式细胞术检测融合基因荧光表达情况,半定量RT-PCR法检测HBV-C基因mRNA表达水平.以筛选的shRNA表达框转染hepG2.2.15细胞,72 h后放免法检测细胞培养上清HbsAg、HbeAg水平,RT-PCR检测细胞HBV pgRNA水平.结果:共转染shRNA表达框能有效抑制融合表达质粒(pC-GFP)荧光强度和HBV C mRNA表达,其中SEC-492i抑制效率最佳,而SEC-282i相对较差.选定的492i表达框(SEC-492i)及282ishRNA表达框(SEC-282i),均呈剂量依赖性抑制hepG2.2.15细胞HbeAg分泌和HBV pgRNA水平,其中SEC-492i抑制HbeAg和HBV pgRNA水平明显优于SEC-282i.结论:在选定的5个siRNA靶位中,以492i靶位RNAi效率最高.tRNAval_shRNA表达框技术可用于抗HBV高效siRNA靶位的筛选,有进一步推广应用价值.
作者：潘修成；陈智；倪勤；羊正纲；徐宁；金晗英
来源：浙江大学学报（医学版） 2006 年 35卷 2期
