目的 基于CRISPR/Cas9系统构建稳定敲除Nestin基因的条件永生性小鼠肾足细胞株(mouse podocyte,MP).方法 利用Cas9过表达慢病毒构建条件性永生小鼠足细胞Cas9过表达稳转细胞系(CAS9/MP).设计Nestin基因的3个位点(KO1、KO2、KO3),并构建3对靶向Nestin基因的sgRNA寡核苷酸序列,将其连接进GV371质粒中,测序验证后,包装慢病毒颗粒,感染构建好的CAS9/MP,嘌呤霉素筛选(Puromycin)阳性克隆细胞,Cruiser TM酶切检测CAS9-sgRNA对目的基因的剪切活性.结果 成功构建了CAS9/MP及GV371-Nes-sgRNA重组载体,CruiserTM酶法验证表明,CAS9-sgRNA2具有剪切活性.结论 建立能稳定敲除Nestin基因的CRISPR/Cas9慢病毒系统,成功获得Nestin敲除的MP稳转细胞株.为进一步研究Nestin在足细胞中的作用机制奠定基础.
作者：黄平；王璐萍；陶颖莉
来源：浙江临床医学 2017 年 19卷 7期
