目的 探讨核呼吸因子-1(NRF-1)对氯化钴(cobalt chloride,CoCl2)诱导细胞凋亡的影响.方法 采用CRISPR在线工具构建NRF-1-sgRNA,CRISPR/Cas9质粒酶切及T4连接酶的连接构建NRF-1基因敲除的慢病毒重组质粒lentiCRISPR-NRF-1-sgRNA,慢病毒包装后转染至NRK-52E细胞,通过嘌呤霉素筛选、流式细胞仪单选、T7E1酶切分析、Sanger测序及Western blot法检测NRF-1基因的表达水平;用含CoCl2(终浓度为600μmol·L-1)的完全培养液将NRF-1敲除组(mutant)、空载体组(vector)和正常对照组(control)细胞培养24 h后,用流式细胞仪检测细胞的凋亡率,用Western blot法检测HIF-1a,Cleaved-caspase-3,Caspase-3,Bax,Bcl-2蛋白表达水平.结果 测序结果显示NRF-1-sgRNA正确插入到lentiCRISPR质粒中,T7E1酶切分析显示,sgRNA2为NRF-1基因的有效靶点;Sanger测序结果证明NRF-1基因的9个碱基被敲除;与vec-tor组比较,NRF-1敲除组(mutant1、mutant2、mutant3)组细胞株中NRF-1蛋白表达水平降低(P<0.01);CoCl2诱导缺氧时,mutant组细胞凋亡率高于vector组和contorl组(P均<0.01);当mutant组细胞与vector组比较时,HIF-1a、Cleaved-caspase-3、Bax蛋白表达水平增高,Bcl-2蛋白表达水平降低(P均<0.01).结论 NRF-1基因的敲除可以增加CoCl2诱导的大鼠肾

作者：董飞；孙红丽；牛楠；李卉；赵瑞；王婵；赵巍

来源：宁夏医科大学学报 2020 年 42卷 4期