目的:研究不同血清型腺相关病毒(adeno-associated virus,AAV)载体介导的外源基因在视网膜中的表达效率,同时比较AAV载体和两种眼科常用启动子组合后转染小鼠视网膜的表达效率高低,为视网膜色素变性基因治疗选择合适的AAV载体与启动子提供依据.方法:AAV病毒根据衣壳蛋白不同可分为不同血清型,本课题选取视网膜疾病基因治疗中常用的AAV2/2、AAV2/5、AAV2/8和AAV2/9四种血清型AAV载体,并以绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)作为报告基因,用GFP的表达强度判断AAV载体介导的外源基因在视网膜中的表达效率.AAV载体纯化后滴度为1.00×1013 mg/L,注射1μL至C57BL/6J小鼠视网膜下腔,于2周取眼球做成冰冻切片,在共聚焦显微镜下观察GFP在小鼠视网膜各层的表达情况.选取在感光细胞内特异性表达最强的AAV2/8于第4周取眼球冰冻切片继续观察是否能持续稳定表达.随后选取眼科基因治疗最常用的广谱启动子CMV和由CMV增强子与鸡β-肌动蛋白启动子组成的CAG启动子,并构建AAV2/8-GFP-CMV和AAV2/8-GFP-CAG两种不同启动子的病毒载体注射至视网膜下腔,于2周取眼球做成冰冻切片,在共聚焦显微镜下观察不同启动子的AAV2/8在小鼠视网膜各层的表达情况.结果:注射AAV-GFP后未见典型的术后细菌感染及明显免疫反应.AAV2/2、AA
作者:胡双;杨丽萍
来源:北京大学学报(医学版) 2020 年 52卷 5期