目的:构建hif-1α基因的RNA干扰表达载体pSilencer3.1-hif-1α,并检测其干扰Hela299细胞hif-1α表达的效率.方法:根据GenBank中hif-1α的mRNA序列,选择设计3对干扰序列,构建sihif-1α重组表达载体,测序正确后经脂质体转染 Hela299 细胞,Trizol试剂盒一步法提取细胞总RNA,应用RT-PCR检测hif-1α的mRNA的表达;单去污剂裂解法提取细胞总蛋白,Western blotting法检测蛋白表达.结果:测序结果显示,测定序列与设计序列完全相同,表明质粒构建正确.转染3个重组pSilencer3.1-sihif-1α表达载体后24 h,Hela299细胞hif-1α的mRNA水平明显降低,对照组hif-1α /GAPDH 比值为0.55,转染pSilencer-sihif-1α-1组hif-1α /GAPDH 比值为0.13,两组比值比较差异有显著性(P＜0.05),转染pSilencer-sihif-1α-2组hif-1α /GAPDH 比值为0.33,两组比值比较差异有显著性(P＜0.05),转染pSilencer-sihif-1α-3组Hif-1α /GAPDH 比值为0.08,两组比值比较差异有显著性(P＜0.01);转染3个重组pSilencer3.1-siHif-1α表达载体后48 h,HIF-1α蛋白的表达水平明显降低.结论:成功构建了Hif-1α基因的siRNA真核表达载体,该载体可有效抑制Hela299细胞hif-1α的表达.

作者：付士波；杨英；王冠军；何平

来源：吉林大学学报（医学版） 2007 年 33卷 5期