目的:构建增强型绿色荧光蛋白与人肝细胞生长因子基因的真核共表达载体并鉴定其在真核细胞中的表达.方法:在HGF两端设计并合成分别带有Sac I和BamH I两酶切位点的一对引物,对pcDNA3.0-HGF载体进行PCR扩增,将扩增出的目的基因与pMD18-T载体相连,并转化大肠肝菌,进行菌落PCR、酶切分析和DNA测序鉴定重组克隆.用Sac I和BamH I将目的片段用双酶切切下后,纯化提取凝胶中的目的DNA片断,然后插入pIRES-EGFP相应的酶切位点,构建pIRES-EGFP/HGF真核表达载体并再进行酶切鉴定.将重组质粒用脂质体法转染至人脐带血管内皮细胞(HUVEC)中,荧光显微镜下观察EGFP在细胞内的表达及Western blotting检测HGF的表达情况.结果:重组克隆载体内的目的片段序列与GENE BANK上报道的HGF基因序列完全一致.pIRES-EGFP/HGF酶切鉴定结果与预期结果一致.荧光显微镜下观察可见转染后的细胞有荧光出现.Western blotting结果表明HGF基因得到了有效表达.结论:本实验成功构建EGFP和HGF真核共表达载体并可在真核细胞中有效表达.
作者：李兴升；王志刚；苏琳；任建丽；杨春江；郑元义；冉海涛；李攀
来源：重庆医科大学学报 2007 年 32卷 5期
