目的利用细茵内同源重组法构建含血红素氧化酶1基因的重组腺病毒.方法用限制性内切酶XhoⅠ+HindⅢ从克隆载体PRH01中切出血红素氧化酶1基因片段,亚克隆至经Sal Ⅰ+HindⅢ酶切的克隆质粒Puc18中,形成转移质粒Puc18-PRHO1,将之用KpnⅠ+HindⅢ双酶切,再次亚克隆至经同样酶切的质粒pAdTrack-CMV中,形成转移质粒pAdTrackPuc18-PRHO1,将之PmeⅠ酶切线性化后与腺病毒基因组质粒pAdEasy-1共转化大肠杆菌BJ5183,抽提经鉴定含目的基因的重组体质粒,PacⅠ酶切后用脂质体转染293细胞,包装成重组体腺病毒Ad-H01.采用PCR方法对重组体腺病毒进行鉴定,利用穿梭质粒pAdTrack-CMV中带有GFP报告基因,对病毒滴度和感染效率进行监测.结果利用CaCl2法由pAdTrack-Puc18-PRHO1和pAdEasy-1共转化BJ5183感受态菌,可获得阳性重组体细菌克隆.PCR检测表明重组腺病毒已含有目的基因,滴度为1.4×1010pfu/ml.结论细菌内同源重组法是一种高效、简便、快捷的重组体腺病毒载体制备方法.所制备的重组体腺病毒Ad-H01在体外能有效表达相应的基因产物,为今后对血红素氧化酶1的深入研究奠定了基础.
作者：戴卫华；吴雄飞；金锡御
来源：重庆医学 2005 年 34卷 10期
