目的 构建适用于革兰阴性菌的快速基因失活载体系统并进行初步应用.方法 应用分子克隆技术构建快速基因失活载体系统.载体成分主要包括:π蛋白依赖件复制起点ori R6K;编码接合转移的mob片段;多克隆位点序列;含有2个Xcm Ⅰ酶切位点的T载体形成片段以及多种耐药片段,包括Chl(氯霉素抗性)、Tet(四环素抗性)、Km(卡那霉素抗性),获得的载体分别命名为EK3-Chl、EK3-Tet、EK3-Km.采用构建的EK3-Tet载体对弗氏枸橼酸杆菌的yeeZ基因进行插入突变,以验证其有效性.通过Xcm Ⅰ酶切EK3-Tet质粒形成T载体状态,将PCR扩增得到的两端截短的yeeZ基因与该T载体直接连接,获得的质粒采用接合方式转移到弗氏枸橼酸杆菌ATCCS090中以实现整合,双抗培养基筛选整合突变株,对获得的突变株进行鉴定和形态观察.结果 成功构建了EK3-Chl、EK3-Tet和EK3-Km,并对yeeZ基因进行插入突变获得突变株,步骤简便,工作周期短.结论 上述构建的载体系统能够对革兰阴性菌进行目的 基因的快速插入失活,该载体可在细菌基因功能研究中得到一定的应用.
作者：龚明福；滕亮；张金龙；黎庶；胡晓梅；陈志瑾；熊坤；丛延广
来源：第三军医大学学报 2009 年 31卷 22期
