目的:构建靶向低氧诱导因子(HIF)-1α基因的CRISPR/Cas9基因敲除质粒,并体外鉴定其敲除效果.方法:设计靶向HIF-1α基因的gRNA序列,将其插入到CRISPR/Cas9质粒骨架载体pCAG-T7中,转化后挑取克隆,进行测序验证.将构建好的重组质粒体外转染人肝癌细胞HepG2和SK-Hep-I,利用嘌呤霉素进行筛选并扩大培养获得HIF-1α基因敲除混合克隆细胞,应用Western blot技术检测未转染细胞和混合克隆细胞中HIF-1α蛋白的表达情况.结果:经测序验证,成功构建了靶向HIF-1α的重组质粒pCAG-T7-HIF-1α-gRNA,经Western blot验证,转染该重组质粒后人肝癌细胞株HepG2和SK-Hep-1经CoCl2诱导HIF-1α蛋白表达明显减弱.结论:成功构建了靶向HIF-1α基因的CRISPR/Cas9基因敲除质粒载体.
作者：何玉婷；李娟；孙冉冉；陈晓龙；申珅；阚全程；余祖江
来源：郑州大学学报（医学版） 2016 年 51卷 3期
