目的:设计合成有效靶向Toll样受体4(TLR4)基因小干扰RNA(siRNA)表达载体,且挑选TLR4基因稳定沉默心肌细胞.方法:依据RNA干扰(RNAi)序列设计原则,以TLR4基因为靶基因,合成3对小发夹RNA(shRNA)寡核苷酸链,经退火、与线性化pSilence 2.1-U6 neo质粒连接、酶切、测序并鉴定.脂质体法转染心肌细胞,新霉素(G418)加压筛选并收集稳定表达质粒的心肌细胞,并观察光镜下心肌细胞形态.RT-PCR及Western Blot法检测收集的心肌细胞TLR4 mRNA和蛋白的表达,确定siRNA对TLR4的抑制效率.结果:测序鉴定插入发夹样序列正确,成功构建了TLR4基因siRNA表达载体;并获得了稳定沉默TLR4的心肌细胞.未见细胞毒性形态学改变.多种方法均证实siRNA作用于TLR4基因后,心肌细胞TLR4 mRNA和蛋白表达均被抑制,其中pSilence2.1-siTLR4-1抑制作用最强.结论:成功构建了靶向TLR4基因siRNA表达载体,并有效抑制心肌细胞TLR4表达.
作者：郑勇萍；李梦云；柯剑娟；吴云；何祥虎；张宗泽；王焱林
来源：武汉大学学报（医学版） 2016 年 37卷 6期
