目的:应用分子生物学技术,构建pIHsp65-Esat6GM共表达质粒,并在真核细胞中表达.方法:以pEGHsp65Esat-6为模板经聚合酶链反应(PCR)扩增出Hsp65-Esat6基因,同时从质粒pORF-hGM-CSF中扩增出基因佐剂hGM-CSF,分别克隆到真核表达载体pIRES的多克隆位点A(MCSA)和B(MCSB)中,构建pIHsp65-Esat6GM共表达质粒,并转染HepG-2细胞中表达和检测.结果:酶切鉴定提示插入的基因片段大小分别为1.93 kb和0.47kb,测序分析表明克隆的Hsp65-Esat6和人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(hGM-CSF)序列与GenBank上公布序列完全一致;Western-bolt检测到Hsp65-Esat6融合蛋白相对分子质量(Mr)为75 000 kDa;RT-PCR方法检测出pIGM,pIHsp65GM和pIHsp65-Esat6GM转染组细胞均有hGM-CSF mRNA表达,三组细胞中hGM-CSF基因mRNA的表达量差异无统计学意义(P＞0.05).ELISA方法检测到pIHsp65-Esat6GM转染组细胞培养上清中hGM-CSF的表达,且与空载体对照组比较差异有统计学意义(P＜0.01).结论:成功构建和表达了pIHsp65-Esat6GM质粒,为研制优于卡介苗(BCG)的新型抗结核病的DNA疫苗奠定了基础.
作者：王森林；张梦媛；王学坤；周曙光；江振友
来源：暨南大学学报（自然科学与医学版） 2016 年 37卷 1期
