目的探讨短发夹RNA（ shRNA）靶向沉默人蛋白激酶Cδ（ PKCδ）对骨肉瘤干细胞增殖、凋亡及相关信号通路的影响。方法根据Genbank数据库中PKCδ序列，设计、合成互补并特异性编码其 shRNA序列（ PKCδ?shRNA?1和PKCδ?shRNA?2），克隆至pRNA6?1?Neo质粒载体后采用Western blotting检测PKCδ蛋白水平，筛选抑制效果最好的shRNA片段转染骨肉瘤干细胞（转染组），设阴性对照组（转染shRNA无意义随机阴性对照序列）和空白对照组（不行转染处理）。采用噻唑蓝（ MTT）法检测各组转染24、48、72、96 h后的增殖抑制率，流式细胞术检测各组转染后的细胞凋亡和细胞周期情况，实时荧光定量PCR检测凋亡相关基因的表达，采用Western blotting检测各组转染96 h后PI3K／Akt及Wnt／β?catenin信号通路中相关蛋白的水平。结果转染PKCδ?shRNA?1和PKCδ?shRNA?2后PKCδ蛋白水平均降低（ P＜0?05），且PKCδ?shRNA?1的抑制效果优于PKCδ?shRNA?2，故后续实验选择PKCδ?shRNA?1；与其余两组相比，转染组的增殖抑制率、凋亡率及促凋亡基因Bax、Bad的mRNA水平均升高，而Bcl?2水平降低，且在细胞周期上，G0／G1期细胞比例升高，但S期和G2／M期细胞比例均降低，以上差异均有统计学意义（ P＜0?05）；转染组PI3K／Akt通路中的PTEN
作者：吕惠成；贾海生；马敏；王明波；吴一民
来源：临床肿瘤学杂志 2015 年 12期
