目的:利用CRISPR/Cas9基因编辑技术, 实现EGFP基因在CHO细胞ACTB基因座位置定点整合和表达, 建立基于CRISPR/Cas9技术的外源基因定点整合和表达技术.方法:根据CHO细胞β-actin (ACTB) 基因起始密码子区基因序列, 设计相应CRISPR/Cas9系统, 同时构建含有ACTB同源臂和EGFP基因的同源供体载体 (donor vector), 通过脂质体转染法同时转染CRISPR/Cas9和供体载体, 流式分选EGFP阳性细胞, 分析基因编辑技术在EGFP基因定点整合和表达方面的可行性.结果:构建了能有效切割CHO细胞ACTB基因的CRISPR/Cas9系统, 筛选到EGFP定点整合至ACTB基因座并有效表达的细胞, ACTB基因缺失后由于γ-actin代偿性表达增强, ACTB缺失细胞形态和生长未受影响.结论:单纯依靠基因编辑技术可以实现1 kb以内的基因同源置换, 但效率较低, 如实现更大片段的外源基因置换, 需借助其它实验技术.
作者：郗永义；吴晓洁；林艳丽；钟荣斌；周艳荣；陈红星；王友亮
来源：现代生物医学进展 2018 年 18卷 19期
