目的 评价基于载体的靶向乙型肝炎病毒(HBV)C基因的小发卡RNA(shRNA)对耐拉米夫定HBV的抑制作用,探讨新的抗病毒治疗手段.方法 从临床耐拉米夫定患儿中提取耐药HBV基因组,经高保真重复延伸及序列拼接后测序,纯化并克隆到pGEM-T Easy TA载体,再经酶切消化,连接入pcDNA3.1载体,构建表达耐药HBV的表达载体pcDNA-HBV-1；根据GenBank收录HepG2细胞系中HBV基因全序列,设计构建针对HBV C基因区的3条siRNA的表达载体pSilencer4.1/HBV-C1,C2,C3.经退火连接入pSilencer-CMV4.1载体.中量超纯提取质粒,定量后与转染试剂siPort XP-1及pcDNA-HBV-1共转染人肝癌细胞系HepG2细胞.分别设立正常HepG2组(未转染组)、载体阴性对照组及共转染组.在共转染后的不同时间点,应用Western blot检测细胞中乙肝病毒表面抗原(HBsAg)蛋白、乙肝病毒e抗原(HBeAg)蛋白的表达；应用实时荧光定量PCR定量检测细胞上清中HBV DNA拷贝的变化.结果 构建的耐药HBV表达载体用于转染HepG2细胞,在转染后的第7天至下次传代前该细胞中可检测到稳定表达的HBV DNA,HBsAg、HBeAg可检出.Western blot结果:在转染的第3天载体pSilencer4.1/HBV-C1、pSilencer4.1/HBV-C2、pSilencer4.1/HBV-C3均可抑制HBV的复制与表达,其中pSilencer4.1/HBV-C2抑制效应尤其显著,

作者：任广立；方颖；马恒颢；张卫云；王鲜艳；许蔓春；罗爱武；赵树进；白雪帆

来源：实用儿科临床杂志 2011 年 26卷 22期