目的:以pAdEasy-1缺陷性腺病毒系统为载体构建用于实验动物模型基因治疗的Ad-VEGF121和Ad-VEGF165重组腺病毒.方法:采用RT-PCR方法从人心肌组织中扩增获得VEGF121、VEGF165 cDNA片段,分别插入pUCm-T载体构成pUC-VEGFs;限制性内切酶Sal I、Kpn I切下目的基因片段,插入pAdTrack-CMV载体相应的多克隆位点构成pAdTrack-CMV-VEGFs.电转法将被Pme I切成线性的pAdTrack-CMV-VEGFs转入E coli BJ5183,与其中的pAdEasy-1同源重组成pAdEasy-VEGFs.阳离子脂质体法将被Pac I线性化的重组子转染293T细胞进行腺病毒包装.转染后7-11 d可在荧光显微镜下观察到绿色荧光蛋白(GFP)呈彗星状,收集细胞反复冻融获得含重组腺病毒的上清液.感染293T细胞3～4次,待细胞出现细胞病变效应(CPE)时收获腺病毒(Ad-VEGFs),并用CsCl密度梯度超速离心进行纯化.结果:重组腺病毒在电镜下呈多面体,形态完整;Ad-VEGF121和Ad-VEGF165病毒滴度分别达到1.155×1012和1.2815×1012V.P/mL.结论:利用pAdEasy-1缺陷性腺病毒系统构建携带目的基因的重组腺病毒方法较简便,易掌握.获得的重组腺病毒纯度高、滴度高,适用于实验动物模型和体外培养细胞的基因治疗.
作者：毛用敏；李汇；赵莉莉；宋衍秋；崔让庄
来源：天津医药 2008 年 36卷 10期
