[目的]表达鱼腥藻苯丙氨酸脱氨酶(AvPAL),并经分子改造降低其最造反应pH.[方法]PCR克隆AvPAL编码基因,并在大肠杆菌中表达,用Ni2+亲和层析柱和凝胶柱纯化重组蛋白.利用GETAREA软件筛选与催化残基距离较近的暴露于酶分子表面的氨基酸位点,将其突变为带电性质不同的氨基酸,并对突变体进行酶学性质研究.[结果]在大肠杆菌中成功表达了AvPAL,纯化后得到电泳纯的重组酶.突变体E75Q和E75R的最适反应pH从8.5分别偏移到7.5和7.0.E75Q在pH 7.5时的比酶活较原酶提高了25％,在pH 6.5-9.5之间酶的稳定性良好,其最适反应温度为50℃,在此温度下保温1h酶活无显著变化.在最适反应条件下,E75Q的kcat/Km值较原酶提高了26.6％.[结论]改变AvPAL酶分子中起路易斯碱作用的关键氨基酸残基(质子受体)附近与之有相互作用的氨基酸的带电性质,降低了AvPAL的最适反应pH,提升了其在医疗领域的应用前景.
作者：黄楠；朱龙宝；周丽；周哲敏
来源：微生物学通报 2015 年 42卷 7期
