目的:针对人p21小GTP酶活化激酶1(p21‐activated kinase‐1,PAK1)基因的3′端非翻译区(3′‐untranslated region ,3′‐UTR)构建PAK1的荧光素酶报告基因载体,并对其进行鉴定和筛选,为后续 PAK1与microRNA‐145(miR‐145)的功能和机制研究提供实验基础。方法用PCR法扩增出 PAK1基因3′‐U T R片段,经连接、酶切插入到pGL3载体上,构建了 PAK13′‐UTR荧光素酶报告基因载体。通过生物信息学方法预测miR‐145可能靶向作用于PAK1基因的3′‐UTR ,后将上述重组质粒以及miRNA mimics(miRNA模拟物)、miRNA‐Con(miRNA control ,miRNA 阴性对照)瞬转到膀胱癌 T24和J82细胞系中,并检测其相对荧光素酶活性。另外,利用实时定量 PCR法检测不同实验组中 PAK1的表达情况。结果成功构建了重组pGL3‐PAK13′‐UTR WT质粒,并通过双酶切以及测序的方法验证所得结果的正确性。且转染 pGL3‐PAK13′‐UTR WT 质粒后, T24/miR‐145组和J82/miR‐145的相对荧光素酶活性显著低于T24/miR‐con和J82/miR‐con组,差异有统计学意义(P<0.05)。另外,通过实时定量PCR法发现,miR‐145 mimics组的PAK1表达水平显著低于miR‐145 con组。结论成功构建了PAK1基因3'‐UTR区荧光素酶报告载体,且miR‐145能
作者:刘伟;寇博;贺大林;郭鹏
来源:现代泌尿外科杂志 2015 年 6期