目的 构建分泌型人内皮抑素(ES)的真核表达载体pEGFP-N1-Endostatin重组质粒,鉴定其蛋白的体外瞬时表达.方法 以pcDNA3-Endo质粒为模板,通过PCR扩增获得人ES基因片段,且在基因前加信号肽序列,将其定向插入真核表达载体pEGFP-N1中,获得重组质粒pEGFP-N1-ES.采用HindⅢ和BamHⅠ双酶切法、PCR法及插入片段序列测定法鉴定该质粒.利用阳离子脂质体介导法,将其转染到人胚胎肾HEK-293细胞中,采用免疫组织化学法和Western blot法检测转染细胞内及培养上清液中ES蛋白的表达.结果 通过HindⅢ和BamHⅠ双酶切、PCR及测序鉴定证明构建出了含ES基因的真核表达载体,且插入片段正确.采用免疫组织化学法和Western blot法检测表明HEK-293细胞内及培养上清中存在相对分子质量为20000的人ES蛋白表达.结论 成功构建了重组质粒pEGFP-N1-ES真核表达载体,转染HEK-293细胞后可稳定有效地分泌人ES蛋白.
作者：詹文芳；蔡善君；刘锐；谢兵；李红；宿罡
来源：眼科研究 2009 年 27卷 10期
