目的:构建携带人端粒酶逆转录酶基因(hTERT)慢病毒表达载体LV3-shRNA-hTERT及其病毒包装鉴定并稳定转染宫颈癌Caski细胞系.方法:使用Designer3.0(Genepharma)软件设计靶向hTERT的小发卡RNA (shRNA)序列,将hTERT-shRNA基因片段插入慢病毒载体pGLV3/H1/GFP+ Puro中,构建慢病毒表达质粒LV3-shRNA-hTERT.通过酶切、DNA测序验证hTERT片段的准确性,将LV3-shRNA-hTERT与包装质粒共转染293T细胞,浓缩上清并测定病毒滴度获得重组慢病毒,将该重组慢病毒感染Caski细胞,通过观测绿色荧光蛋白(GFP)的表达判断转染成功与否以及估计转染效率,RT-PCR、Westem blot分别测定转染后不同时间点的hTERTmRNA水平和hTERT蛋白表达情况,TRAP-ELISA法测定细胞端粒酶活性.结果:LV3-shRNA-hTERT携带正确hTERT基因,重组病毒经PCR证实hTERT-shRNA基因插入.利用重组慢病毒介导将重组质粒LV3-shRNA-hTERT高效转导入宫颈癌Caski细胞并稳定表达,荧光显微镜观察转染后24 h Caski细胞即开始发出绿色荧光,72 h后有大量荧光表达,而在稳定转染空质粒的Caski细胞中不表达.检测转染后的Caski细胞,发现有3条链能明显抑制hTERT mRNA和蛋白水平的表达,并显著降低了细胞端粒酶活性,其中以72H-TERT-1515抑制作用最强,对hTERTm-RNA和蛋白的抑制率分别达75

作者：莫小亮；罗殿中；莫凌昭；赵红珂

来源：中国妇幼保健 2014 年 29卷 4期