目的 利用细菌内同源重组法构建携带凋亡素VP3基因的重组腺病毒并观察其在人结肠癌SW480细胞中的表达.方法 扩增目的基因VP3 cDNA,与EcoRⅤ酶切线性化的pShuttle-IRES-hrGFP穿梭质粒连接构建重组穿梭质粒pShuttle-VP3-hrGFP,PmeⅠ酶切线性化pShuttle-VP3-hrGFP并转化含pAdeasy-1的超感受态BJ5183大肠杆菌,细菌内同源重组法构建重组腺病毒质粒pAd-VP3-hrGFP,并经PCR、EcoRⅤ、PacⅠ酶切电泳及测序鉴定,线性化的重组腺病毒质粒经脂质体包裹转染AD293细胞进行重组腺病毒的包装和扩增,CsCI密度梯度离心法行病毒浓缩和纯化并将其感染人结肠癌SW480细胞中进行表达,观察其感染效率及VP3蛋白表达水平.结果 pShuttle-VP3-hrGFP重组穿梭质粒构建鉴定成功,PCR反应扩增出402 bp的片段;pAd-VP3-hrGFP重组腺病毒质粒经酶切获得大于23 kb的大片段和4.5 kb的片段,重组腺病毒质粒经测序证实VP3-hrGFP编码区成功克隆入腺病毒pAd中,且其序列与GenBank中VP3 CDNA序列完全一致.成功包装出携带VP3基因的重组腺病毒,滴度为1.738×1012 opu/ml,重组腺病毒可在SW480细胞内得到有效表达.结论 用细菌内同源重组法可快速、高效地制备携带凋亡素VP3基因的重组腺病毒,并可在人结肠癌细胞中高效表达.
作者：邓守恒；胡茵；曹风军；蔡晓军；李林均；陈萍
来源：中国老年学杂志 2017 年 37卷 18期
