目的:克隆人TNF-α cDNA,作为人TNF-αmRNA定量检测的标准品.方法:用RT-PCR法从人外周血单个核细胞的总mRNA中逆转录扩增TNF-α的cDNA,将纯化的TNF-α cDNA与pUCm-T载体进行连接,转化宿主菌DH-5α,然后提取重组质粒DNA,用限制性核酸内切酶HindⅢ、EcoRI进行双酶切鉴定并测序分析,最后对质粒标准进行实时荧光定量PCR检测.用聚乙二醇沉淀法纯化质粒并检测λ260 nm吸光度,确定原液的重组质粒拷贝浓度并以此制备荧光定量PCR梯度浓度标准品.结果:酶切鉴定、PCR扩增及测序分析均证实TNF-α cDNA重组到pUCm-T载体上.结论:成功克隆了TNF-α实时荧光PCR定量标准.
作者：郑晓群；邹立林；吕建新
来源：中国免疫学杂志 2004 年 20卷 11期
