目的:验证DNA甲基转移酶1(DNMT1)是miR-148a直接调控的靶基因,探究miR-148a通过靶向DNMT1调控骨髓间充质干细胞(MSCs)向心肌分化的作用机制.方法:MSCs细胞经5′-氮胞苷(5′-aza)诱导向心肌分化后,使用miRNA芯片筛选出诱导前后表达差异的miRNAs.Targetscan软件分析异常表达的miR-148a的靶基因,将野生型或突变型DNMT1的3′-UTR区域克隆到荧光素酶报告基因的下游(DNMT1-wt或DNMT1-mut)并分别与miR-148a mimics(miR-148a模拟物)或scramble(miR-148a阴性对照)共转染,荧光素酶报告基因实验验证所预测的靶基因DNMT1,qRT-PCR和Western blot分别检测转染miR-638 mimics和scramble后,对DNMT1的mRNA和蛋白表达的影响.构建miR-148a慢病毒质粒,分别在转染到MSCs后的第1、7、14和28天后检测miR-148a对GATA结合因子4(Gata-4)基因上游DNA调控序列CpG甲基化水平的影响、qRT-PCR和Western blot分别检测转染miR-148a慢病毒质粒后对心肌特异蛋白:球蛋白重链(MHC)和心脏肌钙蛋白T(cTnT)、MSCs分化特征蛋白CD90和CD29表达的影响,以及对心肌特异转录因子心脏特异性同源盒基因(Nkx2.5)和Gata-4表达的影响.结果:miRNA芯片筛选5′-aza诱导MSCs向心肌分化后表达异常的miRNAs,包括miR-146a-5p、miR-148a、miR-539等,其中miR-148a表达

作者：赖卓莉；蒋昌科

来源：中国免疫学杂志 2017 年 33卷 4期