目的构建和鉴定针对VEGF的发卡样siRNA真核表达载体pU-VEGF-siRNA.方法人工合成一对互补并编码相应短发夹状VEGF-siRNA的寡核苷酸链,将其插入到pSilencerTM 2.1-U6 neo载体中,经测序鉴定所构建的重组载体是否正确;采用电转染方法将构建的重组载体导入人恶性黑素瘤细胞系A375和人结(直)肠癌细胞系LOVO细胞中,用G418筛选得到稳定表达VEGF-siRNA的细胞;采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)、ELISA法分别检测转染细胞VEGFmRNA和蛋白的表达变化.结果经测序证明pU-VEGF-siRNA序列正确;G418筛选得到稳定表达VEGF-siRNA的细胞;转染pU-VEGF-siRNA载体后,A375和LOVO细胞VEGF mRNA和蛋白表达均较对照组明显下降(P＜0.01).结论测序结果表明发卡样的VEGF-siRNA真核表达载体构建成功,转染A375和LOVO细胞后获得稳定表达,并可特异性封闭VEGF的表达,为进一步研究pU-VEGF-siRNA载体在恶性黑素瘤治疗中的作用提供了实验基础.
作者：陶娟；涂亚庭；张晓冰；刘业强；李延；杨森；张学军
来源：中国皮肤性病学杂志 2006 年 20卷 3期
