目的:利用CRISPR/Cas9技术,通过多重sgRNA策略,实现在人原代T细胞中ADRB2基因的快速、高效敲除.方法:针对ADRB2基因5’端组成性外显子设计6条sgRNA,通过与pGL3-U6-sgRNA-PGK-Puro载体连接,构建6个单一sgRNA表达载体,分别与Cas9表达载体瞬时转染HEK-293T细胞;通过T7EN Ⅰ酶切检测其介导的切割效率,筛选出4条高活性的配对sgRNA.继而将4条sgRNA有序串联克隆至pGL3-U6-sgRNA-ccdB-EF1 α-Puro载体,构建成靶向ADRB2基因的多重sgRNA表达载体.瞬时转染HEK-293T细胞后,经T7EN Ⅰ酶切和TA克隆测序明确其对ADRB2基因的修饰效率及方式.通过电穿孔技术将多重sgRNA质粒与Cas9质粒导入人原代T细胞.运用流式细胞术(FCM)检测该方法对靶蛋白β2肾上腺素能受体(β2 adrenergic receptor,β2-AR)的敲除效率.结果:T7EN Ⅰ酶切和TA克隆测序分析的结果均表明,与单一sgRNA相比,多重sgRNA策略可获得更丰富的突变类型和更高的基因编辑效率.突变模式除了碱基的缺失、插入,还有大片段DNA缺失、倒位.随机送检的10个TA克隆全部发生了基因修饰,突变效率高达100％,且均出现了提前终止密码子.FCM检测发现,对照组中β2-AR阳性T细胞比例为43.09％,但转染多重sgRNA/Cas9后β2-AR的阳性表达率下降至25.61％.结论:本研究初步建立了在人原代T细

作者：孙毓；刘丹；施明；郑骏年

来源：中国实验血液学杂志 2019 年 27卷 5期