目的 研究靶向乙型肝炎病毒(HBV)C基因的shRNA(shRNA)诱导RNAi(RNAi)在BHK-21细胞中抑制HBV的复制与表达及抗病毒效果.方法 根据成都军区昆明总医院传染病中心克隆测序的中国56个民族CHB患者HBV基因组(基因型B属ayw1亚型)已在GenBank登录注册:CYN/2002和CYN/2000(GenBank登录号AY517488,AY517489,等),为了监测siRNA功能提供报告基因系统,将HBV C基因PCR产物克隆构建成报告基因表达载体pC-EGFP-N1和载体pCDNA3.1B(-),设计并构建两个靶向同源(CYN/2002和CYN/2000)毒株HBV C基因的长24核苷酸(nt)的shRNA表达质粒(S1和S2),随机设计的用于对照的非同源长24 nt的shRNA表达质粒S3,将其克隆到载体pU6上,构建成表达目的 shRNA重组表达载体,并与pC-EGFP-N1共转染BHK-21细胞.首先在BHK-21细胞中使用BH-2型荧光显微镜观察和FACS-440型流式细胞仪检测绿色荧光蛋白(EGFP)表达细胞数量,评估该shRNA表达质粒在转染后不同时间对C基因/EGFP融合报告基因表达的抑制作用,接着在BHK-21细胞中通过实时荧光定量PCR(RT-PCR)进一步检验了shRNA抗病毒效果.结果 通过BH-2型荧光显微镜观察和FACS-440型流式细胞仪检测,发现在shRNA表达质粒和pC-EGFP-N1共转染BHK-21细胞24 h后,与pC-EGFP-N1或pEGFP-N1单质粒转染相比,S1或S2的共转染组

作者：边中启；孙璐璐；陈维灶；肖安；马世武；崔志磊；刘霜；刘明秋；严维耀；郑兆鑫

来源：中华医学杂志 2010 年 90卷 39期