目的:构建真核表达重组质粒pEGFP-C3-caveolin-1及稳定转染小鼠足细胞.方法:用RT-PCR法扩增小鼠肾脏caveolin-1的开放阅读框(ORF),构建TA克隆,用EcoR Ⅰ、BamH Ⅰ酶切位点亚克隆至真核表达质粒pEGFP-C3中,酶切和测序鉴定.脂质体转染法转染小鼠足细胞,荧光显微镜下动态观察转染后荧光蛋白的表达,培养72 h后,加入选择性抗生素G418(400 mg/L)筛选稳定转染细胞株.RT-PCR及Western-blot检测caveolin-1mRNA及蛋白表达.结果:重组质粒pEGFP-C3-caveolin-1经用EcoRⅠ、BamHⅠ双酶切,产生0.56 kb的目的插入片段及4.7 kb的载体片段,经DNA测序鉴定证实0.56 kb的插入片段与小鼠来源的caveolin-1 ORF序列一致;重组质粒转染小鼠足细胞后8 h在荧光显微镜下观察到绿色荧光,12 h后荧光表达逐渐增多;RT-PCR及Westernblot检测稳定转染细胞的caveolin-1 mRNA及蛋白表达水平为对照细胞的约2-3倍(P＜0.05).结论:重组pEG-FP-C3-caveolin-1真核表达载体包含小鼠caveolin-1完整ORF,稳定转染小鼠足细胞为后续相关研究奠定基础.
作者：任志龙；梁伟；丁国华；胡凤琪；彭建平
来源：武汉大学学报（医学版） 2011 年 32卷 2期
