目的 利用CRISPR/Cas9技术构建RIP1稳定敲除的人永生化表皮细胞HaCaT细胞株,在此基础上对RIP1功能进行探究.方法 针对GenBank中RIP1基因序列,设计靶向RIP1不同外显子的小指导RNA(sgRNA),并将其克隆至SpCas9-2A-Puro V2.0(PX459)载体中,获得PX459-sgRNA基因敲除载体.将上述载体转染HaCaT细胞并通过嘌罗霉素筛选获得阳性克隆,免疫印迹和DNA测序技术进一步鉴定RIP1敲除效果最佳的单克隆.通过CCK-8实验检测RIP1缺失对细胞增殖能力的影响.分别用TNF-α处理HaCaTWT细胞和HaCaTRIP1KO细胞,流式细胞仪检测敲除RIP1对TNF-α诱导细胞死亡的影响,进一步通过胱天蛋白酶(caspase)抑制剂Z-VAD-FMK判断细胞死亡类型.结果与结论 利用 CRISPR/Cas9 系统成功构建 RIP1 完全敲除的细胞模型,功能分析发现敲除 RIP1导致细胞增殖能力减慢;HaCaTRIP1KO对 TNF-α诱导的死亡异常敏感,这种死亡能被 Z-VAD-FMK 显著抑制,证明为caspase 依赖性细胞凋亡.该研究为探究 RIP1 在皮肤损伤中的作用奠定了基础.
作者：陈瑶；刘青；邢微微；陈惠华；张冬冬；王园园；邹民吉；徐东刚；刘中成
来源：军事医学 2017 年 41卷 2期
