目的:构建人乳头状瘤病毒(human papillomavirus,HPV)-16 E6、E7癌蛋白及其突变型的双筛选标记质粒并筛选出稳定表达HPV-16癌蛋白的肺癌A549细胞株.方法:以携带新霉素抗性基因neo的pEGFP质粒(pEGFP-N1)为空载体,在EcoR Ⅰ和BamH Ⅰ位点间插入HPV-16 E6、E7及其突变型基因.新构建的质粒鉴定后转染A549细胞并用G418筛选,多次挑取单克隆后用流式细胞仪分选带荧光的细胞.结果:PCR、双酶切鉴定结果及DNA序列测定结果均证实质粒构建正确；PCR扩增结果显示细胞中存在目的基因；流式细胞术结果显示细胞阳性率高；Western blotting结果显示细胞能表达HPV-16 E6、HPV-16 E7蛋白.结论:成功构建pEGFP-E6、E7质粒并筛选出稳定表达E6和E7癌蛋白的A549细胞株,为进一步研究HPV对肺癌的影响奠定了基础；同时发现G418筛选结合流式细胞仪分选可提高稳定转染细胞的阳性率.
作者：张二盈；李刚；何丽；史景莉；唐旭东
来源：现代生物医学进展 2012 年 12卷 31期
