目的:应用CRISPR/Cas9技术构建去泛素化酶YOD1基因敲除小鼠.方法:针对YOD1基因设计单链向导RNA(sgRNA)识别序列,构建sgRNA质粒,与Cas9质粒体外转录、纯化后注射入受精卵,通过PCR和测序验证得到FO代阳性小鼠.配繁两代后,取同窝对照的野生型(WT)和敲除(KO)小鼠的主要组织器官研磨,使用免疫印迹(WB)技术检测各组织YOD1蛋白的表达,确证YOD1敲除小鼠模型是否成功建立.统计YOD1杂合子(HET)自交存活后代各基因型比例,分析是否有胚胎致死表型.解剖小鼠分析主要组织器官的表型,进一步利用H.E.染色分析KO小鼠是否存在自发的病理改变.通过血糖耐受实验(GTT)分析KO小鼠的血糖调控能力.结果:基因组测序和WB检测结果显示KO小鼠中YOD1被明显敲除,YOD1敲除小鼠模型成功建立.YOD1杂合子自交后代各基因型比例符合孟德尔定律,提示KO小鼠非胚胎致死.YOD1敲除小鼠肝脏显著小于WT小鼠.GTT结果表明敲除YOD1不影响小鼠的血糖稳态.结论:应用CRISPR/Cas9技术成功构建YOD1基因敲除小鼠.KO小鼠正常出生,无任何胚胎发育缺陷.与WT小鼠相比,KO小鼠肝脏显著减小,但无显著的自发病理变化,KO小鼠血糖控制亦无显著差异.
作者：戴红苗；付业胜；张令强
来源：中国生物工程杂志 2018 年 38卷 6期
