目的:构建人骨保护素基因的重组腺病毒载体,并观察在大鼠骨髓基质细胞中的转染能力及表达效率.方法:实验于2004-03/2005-04在第三军医大学完成.采用基因工程技术,将人骨保护素基因片段插入到腺病毒载体质粒pAdTrack-巨细胞病毒上,利用PadEasy系统与骨架质粒在大肠杆菌BJ5183胞内进行同源重组,经293细胞包装、扩增,得到携带人骨保护素基因的重组腺病毒,将携带人骨保护素基因重组腺病毒对大鼠骨髓基质细胞进行感染.采用聚合酶链反应方法对重组腺病毒载体进行鉴定,利用绿色荧光报告基因转染结果,以荧光计数法检测重组腺病毒的滴度,应用Western blot及酶联免疫吸附法检测骨保护素在大鼠骨髓基质细胞中的表达.结果:①酶切鉴定及聚合酶链反应结果证明人骨保护素基因重组腺病毒载体构建成功,病毒滴度可达2.5×109pfu/mL,具有很强感染能力.②人骨保护素基因重组腺病毒载体转染大鼠骨髓基质细胞后48 h,Western blot及酶联免疫吸附法可检测到人骨保护素的蛋白表达.结论:应用细菌内同源重组法,可成功构建含人骨保护素基因重组腺病毒载体,且能高效转染大鼠骨髓基质细胞.
作者：王晓军；王爱民；张忠荣；吴思宇；郭庆山；贺伟峰；汤守营；张全顺
来源：中国临床康复 2005 年 9卷 34期
