[目的]构建人天然Fab段抗体库,并用从肾细胞癌组织中提取纯化的gp96,并以此来筛选抗gp96特异性抗体,为恶性肿瘤的免疫治疗提供新方法.[方法]取健康新鲜血液50 ml,分离淋巴细胞,提取总RNA,经逆转录合成cDNA,设计多对引物,以PCR扩增抗体轻链和重链Fd段cDNA.轻链PCR产物和噬粒载体pComb3经Sac Ⅰ和Xba Ⅰ酶切,由T4 DNA连接酶连接,电穿孔转化感受态大肠杆菌XL1-Blue,扩增后提取噬粒,构建轻链库.轻链库和重链Fd段PCR产物经Xho Ⅰ和Spe Ⅰ酶切,以同样方法连接后转化XL1-Blue,加入辅助噬菌体VCSM13,产生噬菌体抗体金库.提取噬粒酶切鉴定轻链库和金库有无插入片段.分别以噬菌体全库和提取的噬粒为模板,以轻、重链不同引物组合进行PCR扩增.应用亲和层析和离子交换层析从肾细胞癌组织中提取纯化gp96,并以此为抗原对构建的抗体库进行3轮筛选.[结果]提取的淋巴细胞总RNA及逆转录合成的cDNA质量好,部分重链Fd片段、部分κ轻链和λ轻链cDNA得到扩增.Fab库容为1.2×106,酶切和PCR显示有插入片段.用从肾细胞癌组织中提取出的gp96进行3轮筛选,抗体库得到71.5倍的富集.[结论]本研究构建的人天然Fab段噬菌体抗体库可为进一步筛选特异性抗体,用干免疫治疗打下基础.
作者：马小兵；畅继武；李慧忠；李成文
来源：现代预防医学 2010 年 37卷 18期
