目的 提取GⅡ.4型诺如病毒(norovirus,NoV) RNA构建重组表达载体pPIC9K-VP1,并实现NoV-VP1蛋白基因在毕赤酵母(Pichia pastoris)中的高效分泌表达.方法 将GⅡ.4型NoV-VP1蛋白基因插入质粒pPIC9K,得到重组表达载体pPIC9K-VP1,再将酶切后的线性化重组表达载体电击转化进P.pastoris GS115.在发酵的最初阶段分批地向培养基内加入甘油,在甘油耗尽后,通过加入甲醇诱导病毒样颗粒(virus-like particles,VLPs)表达.将摇瓶培养基内的上清液进行超滤浓缩,用透析法脱盐,通过离子交换色谱法纯化,并通过SDS-PAGE、TEM以及Western blot等方法鉴定表达颗粒.结果 目的基因NoV-VP1成功克隆入表达载体pPIC9K中,经过发酵后VLPs蛋白分泌至上清液中.在SDS-PAGE凝胶上显示为表达产物VLPs所对应的62 000相对分子质量条带,使用抗NoV血清Western blot也于62 000相对分子质量处显示了阳性条带,确定VP1蛋白的完整表达.发酵上清液内的蛋白质含量为1 g/L,纯化后约600 mg/L.使用透射电子显微镜(TEM)观察产物颗粒的大小及形态特征,证实其为平均直径约40 nm的NoV-VLPs.结论 该研究阐明了一种利用P.pastoris表达系统高效生产自我组装的NoV-VLPs的方法,这些生产和纯化系统可以用于大规模生产NoV-VLPs,为研发NoV疫苗奠定了基础.

作者：郑岩；贺星；李环；王晓辉；闫志辉；弓三东；李超；崔立红

来源：中华航海医学与高气压医学杂志 2017 年 24卷 2期