目的以聚合酶链反应(PCR)突变方法诱导丙型肝炎病毒(HCV)蛋白酶活性位点ser1165的突变,获得全长非结构基因3(NS3)/4a的表达与纯化. 方法分别以NS3 N端正向引物与诱变反向引物,诱变正向引物与NS4a C端反向引物获得2个PCR产物,产物纯化后在新的PCR反应体系中加入以上2个PCR产物与NS3 N端正向引物、NS4a C端反向引物.再次PCR扩增突变模板,分别与野生型模板重组入表达载体pET26-Ub,转化大肠杆菌BL21(DE3)pCG1,诱导表达后经菌体裂解、纯清化、硫酸铵沉淀、DEAE-Sepharose、NTA纯化,Western blot分析表达蛋白的特异性及PCR诱导突变使HCV蛋白酶活性位点失活的作用. 结果获得诱导突变的模板,Western blot证实该突变可完全阻断对NS3丝氨酸蛋白酶与NS3螺旋酶间的切割,部分阻断了螺旋酶与NS4a间的切割.纯化后的HCV NS3/4a蛋白在SDS-PAGE胶上显示为双带. 结论 PCR突变方法简便、有效,获得丝氨酸蛋白酶失活的NS3蛋白表达,NS3蛋白与NS4a蛋白以复合物形式存在.
作者：魏来；封波；陈勇
来源：中华微生物学和免疫学杂志 2002 年 22卷 1期
