目的:构建人干扰素基因刺激因子(stimulator of interferon genes, STING)沉默子的荧光素酶报告质粒,在人胚肾细胞(HEK293T)和人类宫颈癌细胞(HeLa)中检测荧光素酶活性,生物信息学预测其可能结合的转录因子并通过实验验证。方法:通过PCR扩增人STING-5-1a(-124~+267,相对于转录起始位点,TSS: 0)和STING-5-2a(-124~+168)区域,亚克隆至pGL3-Basic质粒;将人STING沉默子区域STING-5-1b(+169~+267)正向反向亚克隆至pGL3-Control质粒(pGL3-C-5-1b-positive/negative),并把STING-5-1b分为两段互补片段,亚克隆至pGL3-Control载体上,命名为pGL3-C-STING-5-1b-α(+169~+209)/pGL3-C-STING-5-1b-β(+210~+267),双荧光素酶报告活性分析检测上述重组质粒在HEK293T和HeLa中的活性。应用生物信息学方法预测人STING沉默子的转录因子结合位点,将预测结合位点进行多点突变,检测荧光素酶活性。敲低转录因子,免疫印迹试验检测STING的表达水平。染色体免疫共沉淀反应进一步验证转录因子与人STING沉默子的结合。结果:核酸测序证实,上述重组质粒构建成功。截短STING-5-1b(+169~+267)片段后相对荧光素酶活性上升。同时,与pGL3-Control质粒相比,pGL3-C-5-1b-positive重组质粒的相对荧光素酶活性下降(
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作者:庞晓雨;陈海燕;陈林媛;徐华国
来源:中华微生物学和免疫学杂志 2021 年 41卷 5期