对20余种细菌16S rDNAs进行多序列比对与进化树分析,设计铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa,PA)荧光定量PCR(fluorescence quantitative PCR,FQ-PCR)特异性引物.提取PA基因组DNA,以特异性引物扩增16S rDNA靶片段,并构建重组质粒pMDT-Pfr.将梯度稀释的pMD-Pfr质粒作为模板,用于建立定量标准曲线.以SYBR Green Ⅰ荧光染料建立20μL反应体系,对不同浓度的PA DNA样品进行FQ-PCR检测.同时,以金黄色葡萄球菌、伤寒杆菌、福氏志贺菌、变形杆菌、表皮葡萄球菌、大肠杆菌和结核杆菌的基因组DNA作阴性对照,验证FQ-PCR方法检测PA的特异性.结果显示,设计的FQ-PCR引物的靶向序列,仅对PA 16SrDNA有高度同源性;FQ-PCR方法检测PA,其灵敏度达3.6pg/μL的基因组DNA或(2.1×103±3.1×102)拷贝/μL的16SrDNA基因,并且具有很强的特异性;从细菌DNA提取到FQ-PCR检测,可在2h左右完成PA鉴定.较传统的培养鉴定法而言,以16S rDNA作为FQ-PCR靶基因快速检测PA,具有很好的研究价值与应用前景.
作者：薛利军；王永智；任浩；童一民；赵平；朱诗应；戚中田
来源：生物工程学报 2006 年 22卷 5期
