目的:采用体外连接技术构建含红色荧光蛋白(RFP)报告基因的重组腺病毒载体,为基因治疗与基因疫苗研究提供重要工具.方法:将pTurboRFP-N上的含RFP基因片段,经酶切连接定向克隆至转移载体pShuttle上,构成重组质粒pShuttle-TurboRFP-N.用I-Ceu I/PI-Sce I双酶切重组质粒pShuttle-TurboRFP-N和骨架质粒pH5'040 pkGFP- II,回收目的片段,连接,获得重组腺病毒载体AdH5'.040.CMV.RFP-N.将其线性化后,经脂质体介导转染至AD293细胞内包装出重组腺病毒颗粒.通过荧光显微镜观察其在AD293细胞内的包装效率和RFP表达情况.扩增并再次感染AD293细胞检测病毒颗粒感染能力,并测定其生物活性及滴度.将所构建的重组腺病毒载体AdH5'.040.CMV.RFP-N与对照腺病毒载体AdH5.CMV.EGFP 在体外感染人肺癌细胞系A549 和乳腺癌细胞系MDA-MB-231.通过荧光蛋白RFP和EGFP的表达,比较它们对以上肿瘤细胞的感染效率.结果:经酶切鉴定,证明已正确构建重组腺病毒载体AdH5'.040.CMV.RFP-N;经AD293细胞包装成具有感染性的病毒颗粒,并能在真核细胞中高效表达目的基因;扩增纯化后获得重组腺病毒颗粒数为3.6×1015vp/L,滴度达1.8×1013pfu/L.重组腺病毒载体AdH5'.040.CMV.RFP-N感染人肺癌细胞系A549 和乳腺癌细胞系MDA-MB-231的感染效率,高于对照腺病

作者：卢建溪；阳莉；钱师宇；王强

来源：中国病理生理杂志 2011 年 27卷 10期