目的：构建人14-3-3σ基因的原核表达载体，获得其原核表达产物，并对融合蛋白进行纯化及活性检测。方法：采用PCR技术从人乳腺文库中扩增14-3-3σ基因编码序列，将其克隆到pGEX-KG载体中，重组质粒转化大肠杆菌Rossate后表达重组蛋白，利用GST-Sepharose 4B亲和珠对原核表达产物进行纯化，并通过SDS-PAGE和Western印迹检测融合蛋白的表达，采用GST pull-down技术检测已纯化的蛋白与已知体外相互作用蛋白AKT之间的相互作用。结果：从人乳腺文库中扩增获得约750 bp的DNA片段，并成功克隆至pGEX-KG载体上，经双酶切鉴定得到与预期片段大小相符的外源基因插入片段，测序与目的基因序列完全一致；在Rossate菌株中诱导表达出相对分子质量约52000的目的蛋白，SDS-PAGE和Western印迹结果表明融合蛋白表达成功，并纯化得到GST-14-3-3σ融合蛋白；通过GST pull-down技术检测证实GST-14-3-3σ融合蛋白可以和AKT在体外结合，并证实其具有生物学活性。结论：获得了原核表达的活性较好的GST-14-3-3σ蛋白，为后续研究细胞周期蛋白调控机制奠定了实验基础。
作者：黄蓉；徐小洁；王涛；冯滢滢；周丽英；李玲；冀全博；杜楠；叶棋浓
来源：生物技术通讯 2014 年 4期
